Table de matières
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La culture s’est faite dans le laboratoire de culture in vitro de la Bralima Bukavu.
Au cours de ce travail, a été utilisé comme matériel de culture, la levure commune trouvée sur le marché, l’espèce Saccharomyces cerevisiae.
La démarche ici était de tester les différentes doses de sucre pour choisir la concentration favorable, concentration qui sera d’application sur les différents substrats. Ce fruit broyé a été le milieu de culture considéré. Il a été comparé au milieu non sélectif utilisé par la Bralima et fabriqué sur base d’extraits de malt mélangés à l’agar agar et à l’eau.
En ce qui concerne le matériel de conditionnement, les appareils cités ci-dessous ont été utilisés :
-Une centrifugeuse : pour décanter et séparer le substrat de la levure. Connaissant la grosseur de la levure et celle des particules du substrat, la décantation s’est faite en jouant sur le temps et la vitesse de précipitation.
-Une étuve bactériologique : pour maintenir les cultures à une température constante. Au cours de l’expérimentation la culture a été maintenue sous une température de 30°C.
-Un four : pour stériliser le milieu de culture, ramollir les fibres pour ce qui en ont afin de faciliter l’attaque par la levure
-Un spectrophotomètre : pour déterminer la concentration en sucre du substrat et celle de biomasse formée.
Les matériels suivants ont été utilisés à ce niveau :
-Une balance : pour peser la masse des échantillons à utiliser.
-Une coupelle de pesée : récipient dans lequel sont posés les échantillons avant pesée
-Une spatule : ustensile de labo ressemblant à une cuillère qui a servi à la prise des échantillons.
-Verrerie (fiole jaugée (1L), bécher, éprouvette graduée, flacons, pipettes) : pour la préparation des solutions.
Ce poste est constitué de :
-Un poste de chauffage : pour stériliser l’environnement de travail.
-Un autoclave : pour stériliser le matériel de travail.
-un broyeur : pour triturer la mélasse.
Ce poste est constitué de :
-Un microscope : pour le comptage et la détermination du pourcentage des cellules vivantes sur la cellule NEUBAUER.
-Pipette pasteur : pour pipeter et placer les échantillons dans la cellule NEUBAUER
Un hématimètre est une lame de verre spécifique permettant le comptage cellulaire au microscope. Elle se présente sous la forme d'une lame quadrillée possédant des chambres de numérations. Le volume des chambres de numérations doivent être connus pour pouvoir réaliser le comptage.
L'estimation du nombre de cellules par volume chez le mélange initiale peut se faire grâce à l'équation suivante :
Pour convertir le nombre de cellules obtenu par numération, on multiplie le résultat de nombre obtenu au niveau de l’équation du dessus par 0,11 le facteur de conversion de van veen.
2.3.6.1 Traitement de la levure
Le processus de traitement a suivi plusieurs étapes. Toutd’abord,il a fallu mesurer la concentration en biomasse de la levure, avant la mise en culture pour être en mesure de savoir de combien a évolué la biomasse après un temps t de culture.
Avant d’inoculer dans le milieu de culture, procéder aux tests de qualité, de vitalité et de viabilité.
Le test de qualité de la levure, avait pour but de vérifier si la levure utilisée est exempte de tout autre germe. Les germes étrangers que l’on voulait discriminer, étaient catégorisés en trois groupes. Pour chaque groupe, un milieu de culture spécifique a été utilisé.
Ainsi nous avions :
-Le milieu SDA (Shwartz Differential Agar) : pour la détection des germes aérobie totaux. Pratiquement, 1 litre d’eau distillé à été ajouté à 83g de SDA à 40 à 45°C. La solution a été placée dans l’autoclave pendant 15 minutes à 121°C. On y a ensuite incubé de la levure pendant 48h à 30°C.
-Le milieu Raka ray : pour la détection des germes lactiques anaérobies. Pour ce faire, 1 litre d’eau distillée a été ajouté à 74,9g de (DIFCO) ou 77,1g (Oxaid) Raka ray à 40 à 45°C ; on y ajouté 10 mg de tween 80 ; 3g de phénylethane et 7mg d’actidione cycloniximidine. Le tout a été autoclavé pendant 15 min à 121°C. On y a ensuite incubé la levure pendant 5 jours à 30°C.
-Pour la détection des levures sauvages on a utilisé 3g de copper agar extrait de malt. On y a ajouté 5g de peptone, 10g de glucose monohydraté et 20g de bacto agar, le tout dans 1 litre d’eau distillée à 40 à 45°C avec un pH 5±0,1. Le mélange a été autoclavé pendant 15 min à 121°C. On y a ensuite ajouté sous conditions aseptiques 50 ml de sulfate de cuivre stérilisé avant l’incubation qui a duré 48h à 30°C.
Le test de vitalité et viabilité de la levure a servi à déterminer les cellules mortes. Deux réactifs ont été utilisés : le Bleu de méthylène 0,02% à 0,20mg/ml (Solution A) et 0,25ml NaHPO4 0,2M à 28,5g/ml ou Na2HPO4 12 hydraté 0,2M à 71,6g/ml (Solution B). Le mélange de ces deux solutions doit avoir un pH environnant 4,6.
Pour ce faire 1mg de la levure a été dilué avec 9mL d’eau physiologique. Le mélange a été déposé sur la plaquette à goutte. Quelques gouttes des solutions A et B y ont été ajoutées. Au microscope les cellules mortes ont été colorées en bleu. Les cellules vivantes, constituant la population levurienne ont été dénombrées toujours en utilisant un microscope, par soustraction des cellules mortes identifiées.
2.3.6.2. Traitement du milieu de culture
Le traitement du milieu de culture a suivi les étapes suivantes :
-Prélèvementd’une quantité x de mélasse ayant les concentrations en sucre de 130, 1300 et 13000 mg /l.
-Stérilisation avant broyageen vue d’augmenter la surface de contact et ainsi faciliter l’utilisation du substrat par la levure.
il est important de prendre soins de ne pas dépasser la quantité de 100mg pour éviter de gaspiller le substrat et ainsi échapper à l’effet gabtree expliqué dans les généralités.
La procédure de test de qualité a été pareille à celle appliquée à la levure.
2.3.7 Mesure de concentration en biomasse
Soit x la concentration en biomasse. x a été évalué à différents temps grâce au trouble à 620nm en utilisant un spectrophotomètre en mode absorbance. Une absorbance de 1 corresponds à une biomasse sèche de à 0,7g/L.
Taux de croissance était calculé par la formule générale :
X=X0*e (µ*t) (1)
Pour la levure :
-µmax= 0,4 ; ainsi µ= =0,2
La formule (1) devient : X=X0(2,71) 0,2t
Quatre ballons, contenant chacun des substrats à au plus 100mg de concentration (équivalant à 1,3 g de substrat) en saccharose ont été préparés. Une quantitéde biomasse, à savoir 3g, a été inoculée dans chaque ballon.Des prélèvements de solutions ont été faits,au début de l’expérimentation (temps zéro) puis après 48h et 5jours après.
2.3.9 Paramètres observés
Les principaux paramètres ci-dessous ont été mesurés :
-La concentration en biomasse :
-La concentration en glucose : procéder de la même façon que pour la détermination de la concentration en biomasse au spectrophotomètre, à la seule différence que le calibrage change.
-Température et pH : la température était mesurée grâce à une sonde multiparamétrique qui est plongé dans les ballons contenant nos échantillons. La température a été maintenue à 30°C dans une étuve microbiologique.
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