Arrow Table de matières
6103304

CHAPITRE II. MILIEU, MATERIEL ET METHODE

2.1. Milieu d’étude

  1. a) Localisation

L’enquête ethno-mycologique et la cueillette des spécimens des souches des champignons ont été faites dans divers groupements du territoire de Walungu, province du Sud-Kivu, à l’est de la République Démocratique Du Congo. Elles se sont effectuées au cours de la période qui va du mois de janvier à avril 2017. Le territoire de Walungu est situé à 2°35’ de latitude Sud et à 28°40’ de longitude Est avec une élévation variant entre 900 et 2500 m (Kajemba et al., 2010). Dans cette perspective, ces enquêtes ont été réalisées dans les groupements de Mushinga (localité de Karambi, Cishenge et Cirongo), de Kanyola (localité de Luranda, Chibobo et Muhungu), Nyangezi (localité de Kamina) et celui de Kamanyola (localité Rubumba et Kirira). Le territoire a été subdivisé en deux écosystèmes selon l’altitude notamment repartis en moyenne (900-1700 m) et haute altitude (au-delà de 1700 m).

Par contre, les différentes analyses de la composition nutritionnelle ainsi que l’isolement des souches ont été faites dans les laboratoires de la Faculté des Sciences Agronomiques et Environnement de l’UEA.

  1. b) Climat

En général, le climat du territoire de Walungu est humide caractérisé par l’alternance de deux saisons : une saison sèche qui dure 3 mois et une saison de pluie qui dure 9 mois à partir de septembre jusqu’en mai. La température moyenne annuelle est comprise entre 19°C et 23°C (Kajemba et al, 2010) et on y enregistre généralement des précipitations variant entre 1200 et 1800 mm par an.

  1. c) Sols

En général le sol est argileux, de plus en plus pauvre à cause des érosions et de la démographie galopante. C’est ainsi qu’on y rapporte de conflits de terre, la rareté des pâturages et la diminution sensible des activités pastorales (Kakura et al,, 2005).

Par ailleurs, dans certaines zones de ce territoire, on y observe une variété assez complexe des sols, mais de façon spécifique, on y rencontre des sols argilo-sablonneux du type latérite rouge, les sols noirs meubles, les sols caillouteux et les sols alluvionnaires dans les marais et les bas-fonds (Kajemba et al,. 2010).

  1. Végétation

La végétation du territoire de Walungu est constituée des savanes herbeuses, de quelques réserves forestières de Mugaba et Mushwere et des boisements disséminés à travers le territoire pour la plupart par les colons, la Mission Antiérosive (MAE) et le Comité National du Kivu (CNKI) (CAID, 2014).

  1. Zones d’étude des champignons comestibles en territoire de Walungu.

La figure 1  présente la répartition spatiale des souches comestibles sur notre zone d’étude qui est le territoire de Walungu.

Figure 1. Zones d’étude des champignons comestibles en territoire de Walungu

2.2. Matériels utilisés

2.2.1. Matériels mycicoles

Les matériels biologiques utilisés étaient constitués des souches des champignons récoltés dans les différentes aires culturales et végétations du territoire de Walungu.

2.2.2. Matériels d’identification ethno-mycologique

Lors du déroulement des enquêtes ethno-mycologiques, différents matériels ont été d’usage et certains des bases sont ici-bas indiqués :

  • Couteau de poche ou canif (longueur de lame minimum 10 cm) utilisé pour la cueillette de ces souches des champignons,
  • Enveloppe en carton servant pour un entreposage lors de la cueillette et pour une conservation après séchage et étiquetage pour éviter le mélange des spécimens,
  • Appareil photo digital à 8 MegaPixel et GPS (Global Positioning System) respectivement pour la photographie et pour le prélèvement des différentes coordonnées géographiques relatives aux multiples écologies des souches mycologiques,
  • Un mètre ruban et une latte graduée pour prélever les mesures telles que le diamètre des carpophores et la longueur des stipes,
  • Un papier millimétré pour la référence des échelles des photos et étiquetage des photos;
  • La clé d’identification présentée dans Abc taxa (références) utilisée pour l’identification des souches,
  • Une fiche d’enquête, dans la récolte des certaines données ayant traits à l’abondance des espèces et leurs individus ainsi que leurs biotopes, etc.

Le milieu de culture solide préfabriqué du Sabourauds a été utilisé avec d’autres matériels en raison de son pH avoisinant 5,6 – 6,0 qui inhibe la croissance bactérienne. Sa composition étant riche en Peptone (10 g), Glucose massé (20 g), Agar-agar (15 g), vitamines et facteurs de croissance pour la production du blanc primaire. D’autres matériels d’usage ont été utilisés à l’exemple de l’alcool dénaturé concentré à 95% pour la désinfection des outils de travail et des mains. Un appareil à flux laminaire de marque Cleaver  a été utilisé pour maintenir l’asepsie du milieu de travail ; un autoclave de marque Sturdy pour la stérilisation du milieu de culture primaire et secondaire ; une balance de précision de marque KERN pour peser les réactifs à une précision de 0,0001g. En ce qui revient à l’inoculation de la semence secondaire le sorgho additionné au son de riz ont constitué le substrat d’inoculation.

2.3. Méthodes

2.3.1.  Identification et évaluation de la diversité des souches ethno-mycologiques

L’identification des souches des champignons a été faite sous le guide des certains paysans outillés en la connaissance des champignons consommés dans la contrée. La collecte des spécimens était réalisée pendant la matinée et consistait à faire une prospection mycologique sur le site de récolte. Les types de la végétation (savane, champ, jachère ou forêt); leurs coordonnées géographiques, l’écologie du milieu (substrat : nature du sol, humus, bois mort, espèce d’arbre au pied duquel pousse certaines espèces ecto-mycorhiziennes), les habitus de croissances de ces champignons (isolés, grégaires, en touffes, etc.) ainsi que leur distribution étaient déterminés.

Dans cette perspective, il s’en est suivi une cueillette en faisant glisser soigneusement le couteau à la base du champignon, du pied du sporophore afin de ne pas l’endommager et pour le détacher de son support ainsi qu’une bonne conservation dans des enveloppes en cartons entremises dans un sac pour le transport jusqu’à la cité (Hugues et al., 2011).

Par la suite, une identification en référence aux travaux ultérieurs et à la clé d’identification présentée dans Abc Taxa était faite et une comparaison des spécimens différentes.

Une mesure de certains paramètres tels que le diamètre du carpophore, la hauteur du sporophore, le poids du spécimen ont été au aussi collectés. Pour évaluer la diversité des souches, la distribution par m2 des individus de chaque souche a été également déterminée.

2.3.2. Analyses de la composition nutritionnelle de quelques souches des champignons

A l’issu des analyses, divers paramètres ont été testés pour chacune des souches mises en étude selon le protocole utilisé dans le labo de l’UEA.

  1. a) Le pH

Pour l’estimation de l’acidité de ces souches, un échantillon de 20 g a été additionné à une solution de 100 ml d’eau distillée et la mesure du pH a été réalisée à l’aide d’un pH-mètre (AOAC, 2005).

  1. Taux des protéines

Les protéines brutes ont été déterminées à partir du dosage de l’azote total par la méthode de Kjeldhal (AOAC, 2005). L’échantillon, contenant les matières azotées, a subi une minéralisation dans l’acide sulfurique à chaud en présence de catalyseurs. L’ammoniac était ensuite distillé dans un excès de soude puis récupéré dans l’acide borique. La titration de l’azote était réalisée par l’acide chlorhydrique en présence d’un indicateur coloré (rouge de méthyle).  Le pourcentage d’azote était calculé selon l’équation suivante :

N%

 

Taux de protéine

 

La protéine brute était obtenue en broyant les champignons en poudre que nous avions utilisée pour ces différentes analyses. En multipliant la teneur en azote total correspondant par un facteur de convention de 6,25.

  1. Eléments minéraux: Les éléments tels que le phosphore et le Soufre ont été déterminés suivant la méthode Kjeldhal (AOAC, 2005).
  2. Vitamine C

Le mode opératoire utilisé consistait à prélever Vo=5g de champignons broyés et les introduire dans l’erlernmeyer et ajouter ensuite V1=10ml de solution de diiode ;  mélanger en remplissant la burette avec la solution de thiosulfate et ajuster au zéro ; enfin, attendre 5 minutes et ensuite rajouter 4 gouttes d’empois dans l’erlenmeyer puis procéder au titrage de l’excès de diiode par le thiosulfate. Arrêter l’ajout de thiosulfate dès que la solution se décolore.  Noter alors le volume versé dans V2E.

Formule: Co=(NF V 08 – 102, 1998)

Avec :

Co : concentration molaire en vitamine C de substance  analysée ;

 Vo : volume de la solution de champignons ;C1 : la concentration de la solution de diiode(I2), V1 : volume de la solution de diode ajouté au volume Vo de la solution de champignons ; C2 : concentration molaire de solution dithiosufate de soduim(Na2S2O3) ; V2E : volume de la solution dithiosulphate de soduim(Na2S2O3) utilisé jusqu’à la décoloration de la solution composé du diiode (I2)  et du champignon.       

2.3.3.  Isolement des spores des souches mycologiques et leur mise en culture

L’isolement était réalisé sur milieu gélosé solide et préfabriqué du Sabouraud qui fut mélangé dans l’eau à une proportion de 65g pour 1000 ml dans un erlenmeyer puis stériliser à l’autoclave à une température de 1200C et 1 atm pendant 15 minutes. Après les étapes citées, la solution fut coulée dans des boites de pétri. La sporulation était obtenue en plaçant au milieu de la boite de pétri contenant le milieu de culture un morceau de champignon d’environ 2mmx 2mm prélevé au cœur (hyménium) d’un champignon frais à l’aide du scalpel nettoyé à l’alcool et pour d’autres souches les spores recueillis dans les sporophores. Les boites inoculées ont été placées dans un incubateur  où la température était maintenue à 25 °C. Quatre souches mycologiques en culture ont été répétées 3 fois en raison de trois individus d’une souche par bloc.

Dispositif expérimental

Un dispositif complètement randomisé a été  utilisé lors de la mise en culture et consistait à tester les comportements des 4 souches mycologiques (les plus consommées dans le milieu selon ce qui a été révélé par les recherches antérieures) sur milieu de culture Sabouraud. Trois individus d’une souche ont été répliqués. Trois répétitions ont été  effectuées donnant ainsi lieu à 36 traitements comme on peut le voir sur la figure 2 présentant le dispositif expérimental utilisé.

                                                                                              Légende :

                                                                                                     : Schizophyllum

                                                                                                     : Termitomyces

                                                                                                     : Amanita

                                                                                                     : Lentinus

                       
     
   
     
             
 
 
 

Figure 2. Dispositif expérimental pour la semence primaire et secondaire

                                                                                                                         

2.3.2.3. Semences secondaires

Les substrats utilisés pour la préparation de la semence secondaire sont ceux utilisés par (Mugomoka, 2014 ; Nshokano, 2015 et Oei, 2005). Des grains de sorgho étaient mélangés au son de riz car ces substrats ont facilité une bonne croissance du mycélium chez certaines souches déjà testées par les recherches antérieures réalisées dans le milieu. Les grains de sorgho ont été trempés dans l’eau et cuits à l’aide d’une plaque chauffante pendant 25 min, puis essoré au soleil pour débarrasser le sorgho de l’eau en excès.

Le son de riz fut ensuite ajouté au sorgho en raison de 200g pour 2,5 kg de sorgho puis répartis dans les bocaux (300g par bocal). Les bocaux étaient ensuite hermétiquement fermés et un tampon d’ouate était placé au milieu du couvercle vissé et enfin la stérilisation a été faite à l’autoclave à une température de 120 °C et 1 atm pendant 15 minutes. Après celle-ci, les bocaux ont été refroidis pendant environ 45minutes.

  • L’inoculation du mycélium

 L’inoculation du mycélium (semence primaire « stater ») sur le substrat de semis secondaire se déroulait dans la hotte à flux laminaire où des conditions de stricte asepsie étaient réalisées. Le matériel de prélèvement et de transfert de l’inoculum qui est le scalpel était stérilisé grâce à l’alcool et à l’eau de javel. L’incubation des grains de sorgho s’est faite jusqu’à l’obtention du blanc de semis et qui par la suite pourrait être utilisé pour l’ensemencement des semences de fructification.

Les paramètres analysés :

- Taux de reprise de la semence primaire et secondaire : Ce taux est déterminable par la formule suivante :

Nombre total des boites ayant le mycélium/Nombre total des boites repiquées × 100

 

- Longueur et vitesse de croissance : Etait fonction de l’espace occupé par le mycélium par rapport à la surface total du milieu de culture et par unité de temps. La formule suivante a été utilisée : Vn-Vn-1  ensuite de la moyenne de variation était calculée, V1+V2+Vn…,/Nbre des jours, (Vn : Vitesse de croissance au jour n, Nbre : Nombre)

- Le taux d’infection du milieu de culture : Ceci a été  prélevé par une quantification du nombre des bocaux infectés sur le nombre total des bocaux inoculés, multiplié par 100.

2.4. Traitements et analyses statistiques des données

L’encodage et dessin des figures ont été faits à l’aide de Microsoft Excel 2010. Les analyses statistiques des données ont été faites à l’aide du logiciel Statistix version 8.0 et Xlstat 2014. Elles ont consisté à l’analyse de la variance pour les variables quantitatives et au calcul des fréquences pour les variables qualitatives. Là où la différence était significative, la séparation des moyennes a été effectuée à l’aide du test de la plus petite différence significative (LSD) au seuil de signification de 5%. Le test de Khi2 a été utilisé pour voir l’effet de l’habitus, le milieu et la végétation sur la diversité et l’abondance des souches en étude.

Partager ce travail sur :