CHAPITRE II. MILIEU, MATERIEL ET METHODES

I. MILIEU
L’isolement des souches de rhizobium des nodules et leur caractérisation ont été effectués dans le laboratoire de microbiologie des sols de la station IITA-Kalambo à Kalambo localisé à 2o24’00.30’’S et 28o50’42.34’’E. L’évaluation de l’effectivité des souches collectées à la fixation symbiotique de l’azote implique un essai dans la serre où tous les facteurs à part celui sous étude sont, et où la plante hôte est cultivée sur un milieu stérilisé et ainsi les cultures sous test sont appliquées, et la croissance comme réponse est mesurée. Ainsi, dans cette étude, la serre de la station d’IITA-Kalambo a été utilisée à cette fin.
La serre étant un milieu contrôlé, en effet, elle permet de maintenir un environnement optimal pour la croissance de la plante et protégé contre les animaux nuisibles et les variations météorologiques extérieurs : chaleur ou froid excessifs, tempêtes, sécheresse, etc. De plus, elle capte et stocke de manière optimale l’énergie solaire, elle permet ainsi la croissance de plantes dans des zones impropre à la culture (Vaisalla, cité par Andemabika, 2015).
II. MATERIEL
Le matériel biologique était constitué de 31 souches de Rhizobium dont 23 souches nouvellement isolées portant les identifiants de laboratoire suivants Sr1, Sr2, Sr3, Sr4, Sr5, Sr6, Sr7, Sr8, Sr9, Sr10, Sr11, Sr12, Sr13, Sr14, Sr15, Sr16, Sr17, Sr18, Sr19, Sr20, 30S, 12 et 4L. Sept anciennes souches (NAC37, NAC46, NAC48, NAC52, NAC58, NAC80, NAC85) ayant étés testées pour la première fois par Bintu(2013) ont été impliquées. Une souche étrangère commerciale (Biofix) et deux traitements contrôle sans inoculation (un contrôle non inoculé et sans azote minéral noté -N et un autre non inoculé mais avec azote minéral, noté +N).
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Pour les traitements contrôle +N, 100 kg d’N/ha équivalent à 0,2833g de N par pot de 19,8 cm de diamètre ont été appliqués sous forme de nitrate de potassium équivalent à 0,615 g de nitrate par pot une semaine après semis et le traitement contrôle –N n’avait reçu aucune application ni de l’engrais minéral ni de l’inoculation (Woomer et al, 2011).
La variété Hm21/7 du haricot provenant principalement du projet N2 AFRICA de L’IITA a été utilisée comme matériel végétal lors de l’essai et possède les caractéristiques suivantes :
Paramètres Caractéristiques
• Port nain
• type de croissance déterminé
• maturité physiologique 90 à 95 jours
• durée semis-floraison
• couleur des feuilles vert clair
• couleurs des gousses
• couleur des graines brun marron
• poids de 100 graines 39,1g
• Rendement 800 à1500kg/ha
• teneur en fer 75 à79pmm
II.3. METHODE
La méthode utilisée est l’expérimentation au laboratoire et en serre.
II.3.1. Test de présomption et authentification des isolats
Le test de présomption pour authentifier les souches de Rhizobium était fait par observation des manifestations apparaissant dans les boites de
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pétri contenant le milieu de culture (Yeast mannitol Agar), ensemencé par les isolats et incubé dans le noir à 270C afin de s’assurer que les microorganismes isolées des nodules sont des présumés bactéries rhizobium. Les observations sont faites journalièrement depuis le premier jour d’incubation jusqu’à 7ou 8 jours et les manifestations était notées (Woomer et al., 2011). On se servait pour le test de présomption de 2 indicateurs colorés : le Bleu de Bromotymol (BTB) et le Congo Rouge (CR). Trois tests typiques sont effectués pour authentifier ou caractériser les souches de rhizobium. Il s’agit du test sur la croissance des souches, test sur la réaction au BTB et du test sur la réaction au CR.
Pour chaque souche, deux boites de pétri étaient utilisés dont la première contenait le BTB et la seconde le CR. Toutes ces deux boites étaient observées aussi pour la croissance. Sur le total de 30 souches locales sous études, seules 25 étaient caractérisées sur les milieux de culture ; les 7 autres souches provenant de l’ancienne collection étant déjà caractérisées par Bintu (2013) et la souche étrangère appartenant au genre Bradyrhizobium.
Ce test suppose que les colonies typiques de Rhizobium doivent manifester une absence ou faible absorption de la teinture du CR quand elles sont incubées dans le noir. Une couleur bleue indiquant une réaction alcaline sur BTB devrait être obtenue avec les Bradyrhizobiums pp à croissance lente et une coloration jaune (indiquant la réaction acide) est produite habituellement par le Rhizobium spp à croissance rapide ; Les milieux de culture étaient observés après 3-5 jours pour les souches à croissance rapide et 5-7 jours pour celles à croissance lente comme les Bradyrhizobiums pp.
C’est sont les souches avec réaction positive qu’on présume être des souches de Rhizobium. Elles doivent maintenant être évaluées pour leur compatibilité et effectivité à la nodulation et la fixation de l’azote avec la légumineuse cible (Woomer et al., 2011; Bala et al., 2010 ).
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II.3.2. Identification des souches effectives à la croissance et la nodulation du haricot en conditions de serre
II.3.2.1. Préparation des pots de semis
Des pots en plastiques, d’un volume de 3 litres et 19,8cm de largeur chacun ont étés utilisés comme unité expérimentale. Ils ont en un premier temps été forés à leur base, de trois trous de 1 cm de diamètre chacun pour une bonne aération, ils étaient ensuite lavés puis désinfectés par une solution d’éthanol à 95%. Les pots ont été tapissés au fond par les graviers à 10%, puis remplis à 70% de sable préalablement stérilisé à l’autoclave à 1210C pendant plus de 30 minutes. Une couche mince, de 1cm de petits graviers a été épandue uniformément à la surface du sable pour maintenir une surface sèche et réduire l’évaporation.
Le sable grossier est souvent utilisé comme substrat pour supporter la croissance des légumineuses dans ce genre d’expériences. Le sable étant non compactible et non hydromorphe, permet une bonne diffusion des gaz et une bonne absorption des nutriments qui peuvent être entravés dans des substrats argileux.
II.3.2.2. Préparation des souches de rhizobium et pré-germination des graines
Toutes les souches à évaluer étaient cultivées pendant 7 jours avant le semis du haricot. Ces souches étaient ensemencées dans des erlenmeyer de 100 ml contenant 20ml de la solution de milieu de culture , le bouillon du Yeast mannitol (voir annexe 1 : YMA) (Woomer et al., 2011).
Pour la pré-germination de graines du haricot, leur surface a été stérilisée en immergeant ces graines dans l’alcool à 95% dans un bécher sous la hotte pendant 10 secondes pour enlever les matières cireuses. Les graines ont été ensuite immergées dans une solution d’hypochlorite de sodium à 3% pendant 3-5 minutes dans des flacons stérilisés d’Erlenmeyer. Par après, les graines ont été lavées six fois avec l’eau distillée. Après, les graines ont été transférées aseptiquement avec des pinces dans des boites de pétri contenant un papier hygiénique imbibé d’eau. Les boites de pétri ont
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étés incubées à 26°C jusqu'au développement d'une radicule de 0,5 à 1cm de long (Woomer et al., 2011).
I.3.2.3. Dispositif expérimental et traitements
Cet essai de sélection des souches efficaces à la fixation symbiotique de l’azote atmosphérique en milieu contrôlé a été installé dans la serre selon un dispositif expérimental aléatoire complet. Les souches de rhizobium étaient ainsi le seul facteur sous étude. Au total 33 traitements ont été utilisés et répétés quatre fois.
II.3.2.4. Semis et inoculation
Trois trous ont été forés dans chaque pot à une profondeur de 3-4 cm pour un bon enracinement et une meilleure aération. Les graines pré germinées étaient retirées des boites de pétri et placés dans les trous en utilisant des pinces stérilisées, une graine était placée avec la radicelle orientée vers le bas. Après placement de la graine, les trous ont été couverts par le sable.
Les graines ont été inoculées une semaine après le semis avec 1ml de la solution de bouillon de l’inoculum (YMB) par plantule bien formée en utilisant des pipettes stérilisées. Il s’en suivait directement l’élimination de la plantule la moins vigoureuse, ce qui avait réduit à deux le nombre de plantules par pot. Pour ne pas perturber le système racinaire des plantules restantes, la plantule à éliminer n’était pas déracinée mais coupée au collet (Woomer et al., 2011).
II.3.2.5. Conduite de l’essai et récolte
Après le semis, les pots étaient arrosés par intermittence à l’eau stérilisée et à la solution de nutriments trois fois par semaine à intervalle d’un jour sans arrosage. La solution de nutriments utilisée est celle de Broughton et Dilworth, sans azote (Broughton et Dilworth, cités par Woomer et al., 2011). La composition et le mode de préparation de cette solution sont présentés en annexe 1.
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La température journalière dans la serre était contrôlée par deux thermomètres placés dans la serre. La température minimale atteinte était de 14oC et la température max de 48oC, avec une moyenne oscillant entre 26,860C et 33,760C.
Huit semaines après le semis (à la floraison), les plantes ont été excisées au niveau du collet et la partie aérienne séchée pendant 72h par étalement dans la serre. Les racines ont été enlevées des pots et ont été lavées avec soin avec l'eau.
II.3.2.6 Collecte des données
Les paramètres végétatifs suivants ont été observés : le diamètre au collet, la hauteur des plants et le nombre de feuilles 8 semaines après semis. La hauteur était déterminée en utilisant une latte graduée.
L’observation qualitative de la coloration des feuilles des plantes était scorée en comparant les couleurs des plantes des traitements inoculés et celles de non inoculés 8 semaines après semis. Les traitements –N et + N étaient assignés les scores 1 et 3 respectivement, avec les couleurs intermédiaires assignés des score 2 (Ndusha, 2013).
A huit semaines après semis, les plantes étaient déterrées. Pour obtenir les nodules, le système racinaire était enlevé lentement à la main avec soin des sables qui le contenait pour éviter le détachement des nodules. Les racines étaient ensuite lavées lentement à l’eau au robinet.
Les paramètres de nodulation suivants étaient évalués au laboratoire: le nombre des nodules, le poids frais des nodules, poids sec de la biomasse aérienne, la couleur interne et la distribution des nodules. Pour la distribution des nodules, ces dernières sont jugées comme ayant une distribution en couronne (quand les nodules sont groupés autour de la partie supérieure de la racine principale) ou éparpillée dans le cas contraire (Woomer et al., 2011).
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II.3.4. Analyse des données
L’analyse statistique des données a été effectuée avec le logiciel Genstat et les moyennes ont étés séparées par le test de Ducan lorsque la différence s’est avérée significative entre les variantes pour les variables quantitatives. Pour les variables qualitatives (couleur et distribution des souches), l’évaluation par score a précédé leur analyse.