CHAPITRE II. METHODOLOGIE DU TRAVAIL

1. Matériels

Matériels	Utilité	Marque
Ballons jaugés de 100ml ; 50ml	Utilisés pour les préparations de solutions	En Pyrex (Duran 50), BRAND  W- Germany
Balance Electronique	Utilisé pour peser les réactifs	METTLER PE 360 Delta Range ®
Erlenmeyer	Utilisé lors du titrage dans lequel est déversée  la solution à titrer	Duran  Pyrex
Entonnoir	Utilisé pour  transvaser la solution
Plaque chauffante	Utilisée pour le chauffage	LABINCO
pH- mètre	Utilisé pour déterminer le pH	ATC Neuftech
L’anse de platine	Utilisé pour prélever les colonies
Pipette pasteur	Utilisée pour ajuster le volume et prélever très petits volumes	8M
Aspirateur	Utilisé pour aspirer les solutions dans une pipette	Duran Made in Germany
Pipette graduée	Utilisée pour prélever le volume	BRAND W- Germany
Picette	Utilisée pour apporter le volume au trait de jauge car elle contient l’eau distillée et aussi pour rincer avec de l’eau distillée	Kartell® Made in Italie
Pieds gradué	Utilisé pour mesurer le volume	BRAND W- Germany
Agitateur magnétique	Utilisé pour agiter et homogénéiser	L33
Bécher	Utilisé pour chauffer et effectuer quelques essais	Pyrex
Haute à flux laminaire (clean air)	Utilisé pour rendre aseptique l’air	WOERDEN
Incubateur	Utilisé pour maintenir une culture à température définie pour assurer sa croissance	Memmert 854 Schwabach W- GERMANY
Etuve	Utilisé pour stériliser les boites de pétris ainsi que les tubes à essai	Memmert
Lampe à alcool	Utilisé pour aussi pour l’asepsie
Tubes à essai	Utilisé pour la culture des bactéries et aussi pour la dilution de l’échantillon à ensemencer	Pyrex numéro 9825

L’éthanol 70% est utilisé comme désinfectant

2. Réactifs

Réactifs	Maison de fabrication
Na2S203	E. Merck, Darmstadt
Amidon	ALPHA PHARMA
H2O : Eau distillée	BRALIMA
PVP-I2	D-6700 Ludwigshafen
Milieu MUELLER HINTON AGAR	Mast Group  Ltd., Merseyside, U.K.
Milieu GELOSE SCHAEDLER AGAR	Les laboratoires QUELAB
Milieu MAC CONKEY AGAR	Les laboratoires QUELAB
Milieu X.L.D. AGAR	Les laboratoires QUELAB
Milieu MANNITOL SALT AGAR	Les laboratoires QUELAB
Bouillon eau peptonée	Le laboratoire UOB

3. Méthodes
4. Préparation de la povidone iodée 10%

Peser 10g de PVP-I2 sur la balance, le mettre dans un ballon de 100ml. Mélanger  le tout puis ajouter de l’eau jusqu’au trait de jauge, agiter vigoureusement  pour homogénéiser. La solution ainsi préparée sera conservée à une température ambiante (entre 15áµ’C-25áµ’C) dans un flacon brun de 100ml et bien fermé hermétiquement.

1. Identification de la PVP-I₂

1°. Préparation de la solution du test d’identification :

A partir d’une solution de  povidone iodée 10%, préparer une solution de 0,05%. On procédera comme suit :

Nombre de dilution : 10 ̸ 0,05 = 200fois

Soit à préparer 100ml de la solution 0,05% : 100 ̸ ND = 100 ̸ 200 = 0,5ml à prélever dans la solution mère (celle de 10%) dans un ballon de 100ml et ajouter l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Déterminer le pH de cette solution

2°. Mode expérimental

1. Ajouter 1ml d’une dilution contenant environ 0,05% d’iode à un mélange de 1ml d’amidon TS et 1ml d’eau, une couleur bleu foncé est produite.
2. Transférer 10ml dans un ballon conique de 50ml en évitant le contact avec le col du flacon. Recouvrir la bouche du flacon avec un petit disque de papier filtre et l’humecter avec une goutte d’amidon TS : aucune couleur bleue ne s’affiche dans les 60 secondes. (U.S. Pharmacopeia 29-NF24)
3. Dosage colorimétrique du diiode dans la solution de povidone iodée
4. Principe

On doit dire que le dosage d’une solution a pour but de déterminer sa concentration molaire volumique. On dose le diiode I₂ (aq) présent dans la solution diluée et/ou concentrée de la Povidone iodée (10%) par des ions thiosulfate S₂O₃^2- (aq) contenus dans une solution de thiosulfate de sodium 5fois hydraté ( Na₂S₂O₃ .5H₂O ).Cette réaction est unique, totale et rapide. La solution d’ions thiosulfate S₂O₃^2- est la solution titrante et la solution de diiode est la solution à titrer.  

• Les demi- équations issues de ce dosage sont les suivantes :

S₄O₆^2- (aq) + 2è ↔ 2S₂O₃^2- et I2(aq) + 2è ↔ 2I^- (aq)

L’équation bilan d’oxydoréduction est :

                         1I₂ (aq) + 2S₂O₃^2-(aq) ↔ 2I^-(aq) + S₄O₆^2-(aq)

1. Préparation de réactifs

1°. Le thiodène ou l’empois d’amidon : 1g de l’amidon dans 100ml d’eau purifiée puis chauffé à l’ébullition tout en remuant.

2°. La préparation de la solution de Na₂S₂O_{3 .}5H₂O :

M (Na₂S₂O_{3 .}5H₂O) = 0, 1 M; V= 100ml

m= M ˣ Mm ˣ V

    = 2,48g à peser qu’on va dissoudre dans 100ml d’eau distillée

1. Mode expérimental

• Dosage rapide
• Prélever un volume V1꞊10,0ml de solution de Povidone iodée dans un erlenmeyer de 150ml.
• Remplir la burette à l’aide de la solution de thiosulfate de sodium de concentration C2꞊0,1mol/L
• Installer l’agitateur magnétique et placer le turbulent dans l’erlenmeyer
• Effectuer le dosage rapide et repérer l’équivalence : V2꞊ ?ml
• Dosage précis

Il s’agit  de repérer le virage de l’indicateur à la goutte près.

• Recommencer l’expérience précédente en versant rapidement la solution titrante jusqu’à 2ml du volume trouvé précédemment.
• Lorsque le diiode disparait, la solution prend une coloration jaune .Rajouter alors le thiodène (empois d’amidon)
• Terminer le dosage en versant la solution de thiosulfate de sodium goutte à goutte ([email protected])

1. La relation à l’équivalence entre les quantités de matière de I₂ et de S₂O₃^2- est :

n(I₂) ̸ 1 = n (S₂O₃^2-) ̸ 2 (il y a proportionnalité entre les quantités de matière des réactifs titrant et titré).

1. En déduire la relation à l’équivalence entre C(I₂) ; C (S₂O₃^2-) ; V(I₂) et V (S₂O₅^2-) ou Ve

[C(I₂) .V(I₂)] ̸ 1 = [C (S₂O₃^2-). Ve] ̸ 2

1. Exprimer puis calculer la valeur de la concentration molaire C(I₂) de la solution diluée et ̸ou concentrée de la PVP-I₂ :

C (I₂) = [1Ë£ C (S₂O₃^2-) Ë£Ve] ̸ 2Ë£V (I₂) 

1. Déterminer la concentration massique en diiode de la solution PVP-I₂ (diluée et/ ou concentrée).

    Mm I₂ = 254g/ mol

    On connait que la relation de la concentration massique (C massique) = Mm * Cmolaire 

1. En déduire la masse d’I2 dissous dans 100 ml de solution

Donc dans 100ml : Cmassique = masse/ volume(en L)

→ m = CmassiqueË£ V(L)

1. En déduire la masse d’I2 dissous dans 100 ml de solution en pourcentage :

Sachant que 10g de PVP-I₂→ 100%

1. Calculer la quantité de matière de diiode I₂ dans 100ml de la solution de PVP-I₂ :

Sachant la relation : n = m / Mm

1. Détermination du pH de la solution de PVPI préparée

La détermination  du pH se fait à l’aide d’un pH-mètre qu’on va introduire dans la solution préparée de PVPI pour déterminer celui-ci après calibrage de l’appareil.

1. Test Microbiologique
2. a) Préparation des milieux de culture

• Milieu de culture liquide : ce milieu sera préparé à partir de  l’eau peptonée (Bouillon 75g) en pesant 1g de celle-ci dans 100ml d’eau distillée.
• Milieux de culture solide :

‾ Milieu GELOSE SCHAEDLER AGAR : Verser 2,1g dans 50ml d’eau purifiée. Bien mélanger, chauffage en agitant fréquemment puis laisser bouillir pendant une minute. Stériliser à 121°C pendant 15 minutes : refroidir à 45-50°C, mélanger et repartir.

‾ Milieu MAC CONKEY AGAR : Verser 2,5775g dans 50ml d’eau distillée, chauffer à l’ébullition pour dissoudre la moyenne complètement. Stériliser à 121°C à l’autoclave pendant 15minutes.

‾ Milieu X.L.D AGAR (Xylose Lysine Désoxycholate AGAR) : Verser 2,78g dans 50ml d’eau purifiée. Bien mélanger, chauffer en agitant fréquemment, puis laisser bouillir pendant une minute. Ne pas autoclaver. Refroidir à 45 – 50°C ; mélanger soigneusement et repartir

• Milieu MANITOL SALT AGAR: Verser 5,55g dans 50ml d’eau purifiée. Bien mélanger. Chauffer en agitant fréquemment, puis  laisser bouillir pendant une minute. Stériliser à 121°C pendant 15minutes. Mélanger soigneusement et repartir

1. Mode expérimental

• Culture en milieu liquide :

L’échantillon utilisé l’eau stagnante ; Déverser le bouillon nutritif dans les tubes stériles (4tubes) ; Ensemencer avec l’échantillon dilué (soit 0,1fois) tout en flambant ensuite bien fermé les tubes avec le bouchon puis incuber pendant 24heures à 48heures. Observer les résultats

• Culture sur les milieux solides :
• Premier échantillon utilisé : la culture en milieu liquide ; Déverser dans les boites de pétris les 4 milieux de culture solides (déjà préparé), laisser refroidir pendant au moins 5minutes ; Ensemencer avec l’échantillon dilué (soit 0, 1fois) tout en flambant puis bien repartir sur ces milieux et ensuite couvrir les boites de pétris et à la fin incuber pendant 24heures à 48heures. Observer les résultats.
• Deuxième échantillon utilisé : la suspension d’une plaie dans le bouillon eau peptonée ; Déverser dans les boites de pétris les 4 milieux de  culture solides puis laisser refroidir pendant au moins 5minutes ; Ensemencer avec l’échantillon dilué (soit 10^-1fois, soit10^-2fois, 10^-3fois) puis bien repartir sur les milieux solides et ensuite couvrir les boites de pétris et en fin incuber pendant 24heures à 48heures. Observer les résultats.       
• Antibiogramme

Le milieu de culture approprié pour l’Antibiogramme est le milieu MUELLER HINTON AGAR.

• Préparation du milieu MUELLER HINTON AGAR : Dissoudre 1, 8g de poudre dans 50ml d’eau distillée ou desionisée. Autoclaver à 121°C pendant 15minutes. Ne pas surchauffer. Refroidir à 50- 55°C.
• Mode expérimental : Prélever 1à 10 colonies pour faire une suspension équivalente à un bouillon de 18heures ; Inonder la boite entière avec 0 3 à 5cm³ de la dilution en inclinant la boite dans toutes les directions. Réaspirer l’excès soigneusement, sécher les boites à l’étuve à 37°C couvercle légèrement ouvert afin d’éliminer la couche liquide de surface dans laquelle les antibiotiques risquent de se dissoudre. déposer à la surface les disques imprégnés à la Povidone iodée choisis en  les appuyant légèrement à l’aide de la pince; un disque appliqué ne peut être déplacé. Les différents disques doivent être distants. Incuber 24heures à 37°C, mesurer les diamètres. (Jean-Noël JOFFIN et GUY LEYRAL, 1991)