Chap.2 MILIEU, MATERIEL ET METHODES

2.1 PRESENTATION DU MILIEU

        L’étude a été menée dans deux fermes se trouvant dans les groupements de Mudaka et de Bushumba en territoire de Kabare. Les fermes sélectionnées sont des fermes laitières semi-intensives.

• La ferme n°1 (ferme de Nfundiko)

 Cette ferme est située dans le groupement de Bushumba en territoire de Kabare, situé entre 2°19’53,44’’de latitude, 28°49’ 19,67’’ de longitude et à 1500 m d’altitude (Anonyme 2009). Elle a une superficie de 100ha, sa température moyenne annuelle est de19,5°C ; cette région jouit d’un climat tropical humide (Aude, 2007). Ce groupement est limité au nord par le groupement de Miti, au Sud par le groupement de Mudaka, à l’Est par le lac Kivu et à l’Ouest par le groupement de Kashusha (Semy, 2000).

• La ferme n°2 (ferme de René)

Cette ferme est située dans le groupement de Mudaka en territoire de Kabare. Ce groupement est situé entre 2°19’52’’de latitude, de longitude 28°49’ 18’’ et 1498 m d’altitude (Anonyme, 2009). Elle a une superficie de 10 ha. Sa température moyenne annuelle est de19,5°C ; cette région jouit d’un climat tropical humide (Aude, 2007). Ce groupement est limité au Nord par le groupement de Miti, au Sud par le groupement de Bushumba, à l’Est par le lac Kivu et à l’Ouest par le parc de Kahuzi Biega (Semy, 2000).

2.2 Matériels

Les matériels utilisés au courant de cette étude sont:

• Les flacons stériles et la glaciaire qui ont servi à récolter et à conserver les échantillons,
• l’erlenmeyer qui a servi au contenant des milieux de culture pour leur préparation,
• la micropipette, la burette graduée, une pipette en ver graduée, une syringe et une pipette pasteur qui ont servi à mesurer la quantité bien précise de l’eau et des échantillons au cours des analyses ;
• un réchaud qui a servi à chauffer les milieux de culture jusqu’à l’ébullition ;
• des boites de pétri qui ont servi à la culture microbienne;
• des tubes à essai et de portes tubes qui ont servi aussi des contenants pour les milieux de culture, l’eau et les échantillons après leur mesure mais aussi à ensemencer les bactéries;
• un autoclave qui permet la stérilisation à une température bien précise et un temps bien précis des milieux de cultures ainsi que des boites de pétri après leur utilisation ;
• un incubateur qui a servi dans le développement des bactéries sur les milieux de culture ;
• une balance de précision qui a permis de peser les milieux de culture ;
• un microscope, des lames et des lamelles qui ont servi dans l’identification des moisissures et des levures ;
• un ensemenceur et une anse de platine qui ont servi à placer des échantillons sur ou dans les différents milieux de culture,
• une bombonne qui a servi à éliminer les microbes aux alentours du milieu de travail.
  • Méthodes

2.3.1 Le prélèvement 

 L’étude s’est réalisée en condition de traite manuelle dans  deux fermes différentes (fermes de René et de Nfundiko) et dans deux groupements différents (Mudaka et Bushumba).

Les échantillons analysés sont des laits pasteurisés de petit mélange (environ quatre à dix femelles) dans chacune de ces deux fermes. Chaque ferme présente environ 5 vaches qui sont prises au hasard pour la traite. Les prélèvements ont été organisés un jour après la pasteurisation.

Le prélèvement du lait a été fait dans des flacons stériles en plastique de 100 ml le matin et ils étaient acheminés dans une glacière, ce qui permettait de maintenir la température entre 4 à 5°C  jusqu’au laboratoire  de microbiologie de la Faculté de médecine de l’UEA pour les analyses microbiologiques. Le prélèvement se faisait une fois par semaine pendant 4 semaines, ce qui fait au total 16 échantillons.

2.3.2 Préparation des milieux de culture

Les milieux de culture utilisés étaient ;

‒ plate count agar pour l’isolement des flores mésophiles aérobies totales, il est constitué de 5g/l de Tryptone, de 2,5g/l d’extrait de levure, de 1g/l de glucose et 9g/l d’agar ; il a été préparé en pesant 23,5 g de la poudre de plate count agar qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=7,0 ± 0,2.

‒ Gélose de Mac-Conkey pour l’isolement des coliformes fécaux ; il est constitué de 15g/l de peptone de caséine, de 3g/l d’extrait de viande, de 10g/l de lactose, de 5g/l de chlorure de sodium, de 5g/l des sels biliaires, de 0,07g/l de rouge neutre, de 20g/l d’agar, 0,001g/l de cristal violet ; il a été préparé en pesant 58 g de la poudre de la gélose Mac-Conkey qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange a été porté à l’ébullition en agissant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé dans l’autoclavage pendant 15 min à 121°C ; pH =7,1±0,1.

‒ Gélose au sang frais pour l’isolement de staphylocoque ; il est constitué de 10g/l de peptone équilibré, de 12g/l d’agar agar, de 10g/l d’extrait de viande, de 5g/l de chlorure de sodium ; il été préparé en pesant 37 g de la poudre de gélose qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange a été porté à l’ébullition en agissant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé dans l’autoclavage pendant 15 min à 121°C ; après on l’a laissé refroidir puis on a ajouté une quantité du sang frais correspondant à 5% de la quantité de poudre qu’on a utilisé ; pH =7,4 ± 0,2.

‒ Sabouraud glucosée pour l’isolement des moisissures et des levures, il est constitué de 10g/l de peptone mycologique, de 40g/l de glucose, de 15g/l d’agar ; il a été préparé en pesant 65,5 g de la poudre de Sabouraud glucosée qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=5,6 ± 0,2 (Jean-Loup et al., 1992).

2.3.3 Analyse microbiologique

Dans ces analyses, il était question de faire le dénombrement et  l’identification de quelques germes du lait, à savoir les entérobactéries, la levure, la moisissure,…

L’analyse microbiologique de nos échantillons a été réalisée selon la procédure suivante :  

2.3.3.1 Préparation des dilutions

Les différentes dilutions ont été faites comme suit : à l’aide d’une pipette graduée 9ml d’eau distillée ont été prélevés et placés dans différentes tubes à essai, dans le premier tube, on met 1ml du lait ce qui donne 10ml de solution, on obtient ainsi  dans la première tube une solution mère de 10^-1 à partir de laquelle on réalise des dilutions décimales jusqu’à10^-3 qui est l’échantillon qui ensemencé sur les différents milieux de culture. Et ceci a été fait pour tous les échantillons.

2.3.3.2 Dénombrement et identification des germes ou microorganismes dans le lait

Il a consisté à dénombrer les colonies ou à identifier les germes qui ont poussé dans des boites de pétri après incubation. Le dénombrement des différentes bactéries a été réalisé au moyen de géloses sélectives. A la fin de l’incubation, les boites de pétri étaient retirées de l’étuve et les différentes colonies ont été dénombrées et identifiées selon la couleur et la taille au dos des boîtes. 

• Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale
• Mode opératoire

1ml de chaque dilution a été introduit dans une boite de pétri et sur lequel seront versés environ 20ml du milieu plate count agar fondu et maintenu à 35°C après on agite doucement et on laisse la gélose se gélifie pendant un petit moment. Ensuite les boites sont incubées  à 37°C pendant 24h.

Expression de résultats :

Des nombreux colonies se sont développées dans les boites de pétri en formes circulaire et ne comptaient pas plus 100, les nombres ont été exprimés en unité formant colonies par ml de produit (UFC/ml).

• Dénombrement des entérobactéries
• Mode opératoire

Environ 20ml du milieu de Mac Conkey ont été placés dans la boite de pétri qui a été laissée reposer pendant au moins 5 min pour permettre la solidification du milieu ; après l’ensemenceur a été introduit dans  l’échantillon et passé sur la surface du milieu. Ensuite les boites sont incubées dans une étuve à 37°C pendant 24h.

Expression des résultats :

Le développement de coliformes fécaux sur le milieu s’est exprimé par l’apparition des colonies rouge rondes.

• Identification des levures et moisissures
• Mode opératoire

Environ 20ml du milieu de Mac Conkey ont été placés dans la boite de pétri qui a été laissée reposer pendant au moins 5 min pour permettre la solidification du milieu ; après l’ensemenceur a été introduit dans  la solution à ensemencer et sera passé sur la surface du milieu. Ensuite les boites sont incubées dans une étuve à 37°C pendant 24h.

Après incubation, une seule colonie a été diluée dans une goutte d’eau distillée sur une lame et le tout a été couvert par une lamelle et l’observation le tout sera placé sur le microscope pour l’observation.

Expression des résultats :

Des nombreux colonies se sont développées dans les boites de pétri en formes circulaire et de couleur blanche et dans le microscope, des microorganismes qui ont des différentes formes (circulaire, bâtonnet,…) ont été observés.

• Dénombrement des staphylocoques 
• Mode opératoire

Environ 20ml du milieu de gélose au sang frais  a été placé dans la boite de pétri qui a été laissée reposer pendant au moins 5 min pour permettre la solidification du milieu ; après l’ensemenceur a été introduit dans  la solution à ensemencer et sera passé sur la surface du milieu. Ensuite les boites sont incubées dans l’étuve à 37°C pendant 24h.

Expression des résultats :

Elle est négative du fait que les staphylocoques n’ont pas poussé.

• Identification de brucella
• Mode opératoire

Environ 20ml du milieu de gélose trypticase soja a été placé dans la boite de pétri qui a été laissée reposer pendant au moins 5 min pour permettre la solidification du milieu ; après l’ensemenceur a été introduit dans  la solution à ensemencer  et sera passé sur la surface du milieu. Ensuite les boites sont incubées dans une étuve à 37°C pendant 72h.

Expression des résultats. Elle est négative du fait qu’il n’y a pas eu développement de brucella.

La température et la durée d’incubation auxquelles les bactéries sont ensemencées dans différents milieu de culture, sont représentées dans le tableau 1.

Tableau 5 : la température et durée  d’incubation  des bactéries dans différents milieux de culture

Bactéries	Milieux de culture utilisés	Température d’incubation	Durée d’incubation
Flore totale	Plate count agar	37°C	24h
Coliformes fécaux	Mac Conkey	37°C	24h
Moisissure et levure	Sabouraud	37°C	24h
Entérobactéries	Mac Conkey	37°C	24h
E. coli	Mac Conkey	37°C	24h
Salmonella	Mac Conkey	37°C	24h
Staphylocoque	Gélose au sang frais	37°C	24h
Brucella	Gélose trypticase soja	37°C	72h

• Identifications biochimiques

Pour les identifications des souches à partir des résultats des tests biochimiques, nous avons utilisé les milieux suivants :

‒ Milieu de kligler est constitué de 3g/l d’extrait de la viande de bœuf, de 3g/l d’extrait de levure, de 20g/l de peptone, de 5g/l de chlorure de sodium, de 10g/l de lactose, de 1g/l de glucose, de 0,3g/l de citrate ferrique, de 0,3 de thiosulfate de sodium, 0,05 de rouge de phénol, de 12g/l d’agar ; il a été préparé en pesant 54,7 g de la poudre de kligler qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=7,4 ± 0,2.

‒ lysine de fer est constitué de 5g/l de peptone bactériologique, de 3g/l d’extrait de levure, de 1g/l de glucose, de 10g/l de L-lysine, de 0,5g/l de citrate de fer ammoniacal, de 0,04g/l de thiosulfate de sodium, de 0,02g/l de Bromocrésol pourpre, de 14,5g/l d’agar; il a été préparé en pesant 34 g de la poudre de lysine de fer qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=6,7 ± 0,2.

‒ SIM est constitué de 20g/l de Tryptone, de 6,1g/l de peptone, de 0,2g/l de sulfate d’ammonium et de fer, de 0,2g/l de thiosulfate de sodium , de 3,5g/l d’agar ; il a été préparé en pesant 30 g de la poudre de lysine de fer qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=7,3± 0,2.

‒ Milieu au citrate pour l’isolement des entérobactéries, il est constitué de 0,2g/l de sulfate de magnésium, de 0,2g/l de Dihydrogénophosphate d’ammonium, de 0,8g/l de phosphate d’ammonium et de sodium, de 2g/l de citrate de sodium, de 5g/l de chlorure de sodium , de 0,08g/l de bleu de bromothymol, de 15g/l d’agar ; il a été préparé en pesant 23,3 g de la poudre de lysine de fer qu’on a dilué dans un litre d’eau distillée ; le mélange est porté à l’ébullition en agitant fréquemment jusqu’à la dissolution complète ; enfin il a été stérilisé pendant 15 min à 121°C dans l’autoclave ; pH=7,0± 0,2 (Jean-Loup et al., 1992).

• Mode opératoire

Pré-enrichissement

Environ 20ml du milieu de Mac Conkey ont été placés  dans la boite de pétri qui a été laissée reposer pendant au moins 5 min pour permettre la solidification du milieu; après l’ensemenceur a été introduit dans  l’échantillon et passé sur la surface du milieu. Ensuite les boites sont incubées  dans une étuve à 37°C pendant 24h.

Enrichissement

Après incubation, une seule colonie a été diluée dans l’eau distillée à l’aide d’une anse de platine qui a été introduite dans le milieu de kligler au fond puis sur la pente, ce même anse a été passée sur la pente en milieu de citrate et en milieu de lysine de fer et enfin elle a été introduite uniquement au fond du milieu de SIM. A la fin ces milieux ont été incubés dans l’étuve pendant 24h à 37°C.

Expression des résultats :

Dans le milieu de kligler, il y a eu changement de la couleur rouge en couleur jaune sur le fond et sur la pente, la présence de gaz, et de la couleur noire ; dans le milieu de citrate, il y a eu changement de la couleur verte en bleu et dans le milieu de lysine de fer, il y a eu changement de couleur. Le Kovac a été ajouté dans le milieu de SIM pour vérifier la mobilité des germes. 

2.3.4 Analyses statistiques

L’encodage des données et les statistiques descriptives étaient réalisés dans le package Excel. Ensuite, le logiciel XLSTAT version 2012, nous a permis de faire les statistiques descriptives pour les variables quantitatives.